如何设计siRNA：从原则到实践

引言

自1998年Fire和Mello首次提出RNA干扰（RNAi）概念以来，siRNA（小干扰RNA）已成为基因功能研究中不可或缺的工具。siRNA通过与靶向特异性的mRNA结合，介导其降解，从而实现基因沉默。本文将综合多篇权威资料，详细阐述siRNA设计的原则与步骤，助力科研人员高效开展RNAi实验。

siRNA设计原则

靶向位点选择

• 从靶基因起始密码子AUG下游50～100个核苷酸开始搜寻理想的siRNA序列，越靠近靶基因的3’端，其基因沉默效果可能越好。
• 在靶向mRNA序列中找到一段21 nt的以AA二核苷酸起始的序列，记录下每一个AA及之后3’相邻的19个核苷酸作为潜在的siRNA靶向位点。
• 确保siRNA序列高度同源于靶基因而无与其他基因同源的序列，以避免非特异性沉默。

序列组成与结构

• siRNA序列最好为AA(Nn)UU(N代表任意碱基；n为碱基数目，在19～29 nt之间)，NA(Nn)UU和NA(Nn)NN序列也可以。
• 建议用dTdT取代3’端的2个碱基突出，增强siRNA双链复合体的稳定性。
• G/C含量在30%～52%的siRNA序列，其沉默基因效果较好。
• 正义链的第一位和第十九位碱基为A；正义链的第十位碱基为U；正义链的第十三位碱基不为G；正义链的第十九位碱基不为G或C时，siRNA序列具有较高的基因沉默效率。

避免不利结构

• 连续2个以上的G和C会降低双链RNA的内在稳定性，连续3个以上的U和A可能终止由RNA Polymerase III介导的转录。
• 多个siRNA位点最好分散分布在mRNA全长上，以减少因mRNA二级结构或蛋白结合屏蔽而影响siRNA效果的风险。

siRNA设计步骤

获取靶基因序列

在NCBI上找到靶基因的目的片段，如果靶基因有多个转录本，需将所有NM号所对应的CDS序列放在Clone Manager中比对，并选择拥有序列CCDS进行设计。

在线工具辅助设计

利用siRNA设计工具，如siDirect、DSIR、Invivogen、Ambion siRNA Target Finder等，输入靶基因序列，根据工具提供的评分和建议选择合适的siRNA候选序列。

验证与优化

• 将siRNA候选序列进行BLAST分析，确保其与靶基因特异结合，不与其他基因发生显著同源性。
• 选择至少3条靶点相差25bp以上的候选siRNA序列进行化学合成，通过实验筛选出沉默效率最高的siRNA序列进行下一步的基因功能研究。

注意事项与建议

• 一个目标基因至少设计3-5个以上的siRNAs，平行实验以提高成功率。
• 化学修饰siRNA可以增强其在血清、体内及细胞培养中的稳定性，延长作用时间。荧光标记siRNA可用于观察转染效率、优化转染条件以及进行siRNA胞内定位及双标记实验。

结语

siRNA设计是RNAi实验成功的关键第一步。遵循上述原则与步骤，结合在线工具的辅助，科研人员可以高效地设计出特异性强、沉默效率高的siRNA，为基因功能研究提供有力支持。然而，siRNA的最终活性仍需通过实验来验证，不断优化与调整是实现高效RNAi的必经之路。