流式抗体选择全攻略

在生命科学研究领域，流式细胞术凭借其独特优势，已成为不可或缺的技术手段。它能在单细胞水平上对细胞的多种生物学特性进行快速、准确的定量分析，还能实现目标细胞的分选，为后续的细胞功能研究提供纯净的细胞样本。然而，想要获得理想的流式实验结果，合理选择流式抗体至关重要。接下来，将从多个维度详细介绍选择流式抗体时的要点。

一、抗体的基本要求

（一）明确靶标位置

在实验开始前，精准确定待测靶标是位于胞内还是胞外蛋白，这是实验成功的基础。胞内和胞外蛋白的检测流程之所以存在显著差异，是由细胞的结构和功能特性决定的。对于胞内蛋白，由于细胞膜的阻隔，抗体无法直接进入细胞内部与靶标结合，因此需要对细胞进行固定和通透处理。固定过程通常使用多聚甲醛等试剂，多聚甲醛能够与细胞内的蛋白质分子发生交联反应，形成稳定的共价键，从而使细胞形态和蛋白结构稳定，防止在后续操作中蛋白发生移位或降解。通透则是利用 Triton X-100 等表面活性剂，Triton X-100 的分子结构包含亲水性头部和疏水性尾部，疏水性尾部能够插入细胞膜的脂质双分子层中，亲水性头部则暴露在膜外，从而在细胞膜上形成微小孔隙，使抗体能够顺利进入细胞内与靶标结合。而检测胞外蛋白相对简单，直接将抗体与细胞进行孵育，抗体就能凭借其特异性的抗原结合位点与细胞表面的靶标特异性结合。若混淆靶标位置，可能出现抗体无法接触到靶标，导致假阴性结果；或者因处理不当，造成细胞损伤和背景信号增强，影响实验结果的准确性和可靠性。例如，在检测细胞内的细胞因子时，如果未进行通透处理，抗体无法进入细胞，就会检测不到细胞因子的表达，得出错误的阴性结论。

为了更准确地明确靶标位置，科研人员可借助一些专业网站获取信息。比如 “中国知网（https://www.cnki.net/）”，这是国内最大的学术文献数据库，涵盖了海量的生命科学领域研究论文。在该网站上，通过关键词搜索，如 “胞内蛋白检测”“胞外蛋白检测方法对比” 等，能找到众多相关研究成果。这些文献不仅详细阐述了不同靶标位置蛋白的检测原理和方法，还包含了大量实际案例和经验总结，有助于科研人员深入理解其中的差异，为实验方案的设计提供理论支持。

还有 “PubMed（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）”，作为全球知名的生物医学文献数据库，汇聚了来自世界各地的科研文献。它的优势在于文献更新速度快，涵盖范围广，涉及生命科学的各个领域。在明确靶标位置时，科研人员可以利用 PubMed 搜索最新的研究动态和前沿技术，了解不同实验室在相关研究中的具体操作和遇到的问题及解决方案，从而避免在自己的实验中走弯路。

另外，一些专业的细胞生物学网站，如 “Cell Signaling Technology（https://www.cellsignal.com/）”，该网站专注于细胞信号通路研究，不仅提供各类细胞内信号分子和细胞表面标志物的详细信息，还介绍了针对不同靶标位置的检测技术和抗体应用指南。网站上的产品说明书和技术文档详细说明了各种抗体适用的靶标类型，以及对应的样本处理方法，能帮助科研人员精准判断待测靶标的位置，并选择合适的抗体和实验方法 。

（二）依据样品来源选择抗体反应性

不同物种的蛋白在氨基酸序列和结构上存在差异，这就要求我们必须严格依据样品来源选择具有相应反应性的抗体。以常见的实验动物小鼠、大鼠和人类为例，尽管某些蛋白在进化过程中具有一定保守性，但细微差别依然存在。这种差别主要体现在抗原表位的氨基酸组成和空间构象上。例如，人源和鼠源的某些免疫球蛋白在结构和抗原表位上有所不同，如果使用人源抗体检测小鼠样品中的蛋白，抗体可能无法准确识别小鼠蛋白的抗原表位，从而无法产生特异性结合，最终得出错误的阴性结果。在选择抗体时，一定要仔细查看产品说明书，产品说明书中通常会详细列出抗体的反应性信息，包括适用的物种、交叉反应情况等，确保抗体的反应性与样品来源相匹配，以保证实验结果的准确性。

（三）选择专用抗体

必须选用明确标注可用于流式实验的抗体，普通抗体不能随意替代。流式实验对抗原抗体反应有着特殊要求，不仅需要抗体具备高度特异性以精准结合靶标蛋白，还需考虑其与流式细胞仪的兼容性，以及在多色实验中与其他抗体的相互影响。普通抗体在标记方式、标记效率、亲和力以及与细胞表面其他成分的非特异性结合等方面，可能无法满足流式实验的严格要求。例如，普通抗体的标记方式可能不够稳定，在实验过程中容易发生荧光素脱落，导致荧光信号减弱或消失；标记效率低可能使抗体上结合的荧光素数量不足，影响检测灵敏度；亲和力不足则可能导致抗体与靶标结合不牢固，在洗涤过程中容易脱落，造成假阴性结果；与细胞表面其他成分的非特异性结合会增加背景信号，使阳性细胞群和阴性细胞群难以区分。使用普通抗体替代可能会导致染色效果不理想，出现背景信号过高、阳性细胞群和阴性细胞群难以区分等问题，严重影响实验结果的准确性和可重复性。

二、流式细胞仪的要求

（一）了解激光器配置

在选择流式抗体前，深入了解所用流式细胞仪的激光器配置至关重要。常见的激光器波长有 405nm、488nm 和 633nm 等，目前大多数流式细胞仪配备 488nm 和 633nm 两个激光器。不同波长的激光器可激发不同的荧光素，这是基于荧光素的分子结构和能级特性。当激光照射到荧光素分子上时，光子的能量被荧光素分子吸收，使分子从基态跃迁到激发态，激发态的分子不稳定，会迅速回到基态，并以发射荧光的形式释放出多余的能量。例如，488nm 激光器能激发 FITC（异硫氰酸荧光素）、PE（藻红蛋白）等荧光素，633nm 激光器可激发 APC（别藻蓝蛋白）、AF647 等荧光素。只有清楚知晓仪器的激光器配置，才能针对性地选择合适的荧光标记抗体，确保抗体上的荧光素能被仪器的激光器有效激发，产生可被检测和分析的荧光信号。若选择的荧光素无法被仪器的激光器激发，实验将无法获得有效数据。一些高端流式细胞仪还配备了更多波长的激光器，如 561nm、640nm 等，这些额外的激光器为实验提供了更多荧光素选择的可能性，但也要求科研人员更深入地了解不同激光器与荧光素的匹配关系，例如，561nm 激光器可激发一些新型荧光素，如 PE-Texas Red 等，这些荧光素在多色实验中能够提供更丰富的荧光信号组合，但需要注意其与其他荧光素的光谱重叠情况和补偿调节。

（二）知晓检测通道数量

除了激光器配置，了解每个激光器下的检测通道数量也不容忽视。检测通道数量决定了一次实验最多能同时检测的指标数量。以双激光的流式细胞仪为例，488nm 激光器下通常设有多个检测通道，如 530/30 通道用于检测 FITC、AF488 等荧光素发射的荧光信号，575/26 通道用于检测 PE 荧光素的发射光等；633nm 激光器下同样有相应的检测通道，像 660/20 通道用于检测 APC、AF647 等荧光素的发射光。这些检测通道的设置是基于不同荧光素的发射光谱范围，通过特定的滤光片组合来实现对不同荧光信号的选择性检测。清楚了解检测通道数量有助于合理设计实验，避免因通道限制而无法同时检测多个感兴趣的指标，或者出现荧光素与检测通道不匹配的情况，确保实验能够顺利进行并获取全面的数据。不同型号的流式细胞仪，其检测通道的具体配置和性能可能存在差异，科研人员在使用前需要仔细阅读仪器的操作手册，了解每个通道的检测范围、灵敏度等参数，以便更好地选择和使用抗体。例如，某些流式细胞仪的检测通道灵敏度较高，适合检测低表达水平的靶标；而另一些通道的检测范围较宽，可用于检测表达水平差异较大的多个靶标。

三、荧光标记的选择

（一）优先选择直标抗体

在条件允许的情况下，应优先选择直标抗体。直标抗体是将荧光素直接标记在识别靶标的一抗上，而间接标记则需先使用未标记的一抗与靶标结合，再用标记有荧光素的二抗与一抗结合。与间接标记相比，直标抗体具有明显优势。首先，它减少了实验步骤，简化了操作流程，降低了实验误差的产生概率。每增加一个实验步骤，就增加了一次操作失误的风险，如二抗孵育时间过长或洗涤不充分，都可能导致非特异性结合增加或背景信号升高。其次，间接标记在多次清洗过程中，容易造成细胞损失，尤其是对于样本量有限的珍贵样本，细胞损失可能导致实验结果不准确。此外，间接标记涉及二抗的使用，增加了非特异性结合的风险，可能使背景信号升高，降低染色准确性。在对稀有细胞样本进行检测时，直标抗体能够最大程度减少样本损失，同时保证实验结果的可靠性。但在某些特殊情况下，如无合适的直标抗体，且能确保间接标记不会产生交叉反应和高背景时，也可谨慎使用间接标记抗体。例如，在研究一些罕见的细胞表面标志物时，如果没有商业化的直标抗体，可通过优化间接标记的实验条件，如严格控制二抗的浓度和孵育时间，加强洗涤步骤等，来获得可靠的实验结果。

（二）根据靶标表达强度选择荧光素

对于弱表达靶标，应优先选择强荧光素标记的抗体。不同荧光素的荧光强度存在差异，常见荧光素的强度排序为 PE>APC>FITC>PerCP 。这种强度差异主要源于荧光素的分子结构、量子产率等因素。量子产率是指荧光素分子吸收光子后发射荧光的效率，量子产率越高，荧光强度越强。当检测细胞表面或细胞内低表达水平的蛋白时，使用强荧光素标记的抗体可以显著提高检测灵敏度。强荧光素能够产生更强的荧光信号，使表达低水平靶标的细胞更容易与阴性细胞区分开来，有效减少假阴性结果的出现。比如在检测细胞表面低表达的某种受体时，选择 PE 标记的抗体可以增强荧光信号，使阳性细胞群在流式细胞仪检测中更加明显，便于准确分析细胞亚群。除了常见荧光素，新型荧光素如 Alexa Fluor 系列和 eFluor 系列也逐渐在流式实验中得到应用。Alexa Fluor 系列荧光素具有更高的亮度、优良的激光稳定性和对 pH 值的不敏感性，这使得它在不同实验条件下都能保持稳定的荧光信号；eFluor 系列荧光素则在多色实验中展现出较好的性能，能够提供更多的荧光选择，满足科研人员对复杂实验的需求。例如，Alexa Fluor 647 在 633nm 激光器激发下，具有很强的荧光强度和良好的光稳定性，适用于检测低表达靶标和进行多色实验；eFluor 450 在 405nm 激光器激发下，可用于与其他常见荧光素组合，实现更多指标的同时检测。

四、多色搭配方案

（一）单一通道标记原则

在设计多色实验时，必须遵循每个通道只能使用一种标记的原则。例如，FITC 和 AF488 的激发波长和发射波长相近，如果同时在一个通道中使用这两种标记，流式细胞仪在检测时将无法准确区分它们发出的荧光信号，导致数据混乱，无法对各个指标进行准确分析。这是因为流式细胞仪通过检测荧光信号的波长和强度来识别不同的荧光素，当两种荧光素的光谱高度重叠时，仪器无法准确分辨它们各自的信号。因此，为确保实验结果的准确性，在选择抗体和荧光素搭配时，务必保证每个检测通道只使用一种荧光标记的抗体。这就要求科研人员在实验设计阶段，充分了解不同荧光素的光谱特性，合理规划每个通道所使用的荧光标记，避免出现通道冲突。可以通过查阅荧光素的光谱数据手册或使用专业的光谱分析软件，来详细了解不同荧光素的激发和发射光谱范围，从而做出科学的选择。

（二）减少光谱重叠

尽量避免选择光谱重叠严重的荧光素组合。以 PE-cy5 和 APC 为例，两者同时使用时调补偿值过大。光谱重叠是指不同荧光素发射的荧光光谱部分重合，这会导致在检测某一种荧光素信号时，受到其他荧光素信号的干扰。当补偿值过大时，会引入更多的误差，影响实验结果的可靠性。因为补偿过程是基于对光谱重叠程度的估算进行调整，过大的补偿值意味着估算误差对结果的影响更大，可能导致细胞亚群的误判。所以，在选择多色抗体搭配时，应充分考虑荧光素的光谱特性，尽量减少光谱重叠，降低补偿的难度和误差。科研人员可以借助专业的光谱分析软件，查看不同荧光素的光谱图，直观地了解它们之间的重叠情况，从而更科学地选择荧光素组合。例如，通过光谱分析软件可以发现，PE-cy7 与 APC 的光谱重叠较少，在多色实验中，用 PE-cy7 替代 PE-cy5 与 APC 搭配，能够有效降低补偿难度，提高实验结果的准确性。

（三）合理匹配靶标与荧光素

遵循弱靶标配强荧光素的原则。以 Treg 细胞检测为例，Treg 细胞中 CD4 表达量高于 FoxP3。在这种情况下，为了清晰区分不同表达水平的靶标，FoxP3 应使用强荧光素标记抗体。这样可以使低表达的 FoxP3 产生足够强的荧光信号，与高表达的 CD4 区分开来，便于准确分析 Treg 细胞亚群。在实际实验设计中，根据靶标在细胞上的表达丰度来选择合适强度的荧光素标记抗体，能够优化实验结果，更清晰地展示不同细胞亚群的特征。对于一些表达水平相近的靶标，还可以通过调整抗体浓度、孵育时间等实验条件，进一步提高检测的准确性和分辨率。例如，在检测两种表达水平相近的细胞表面标志物时，可以适当提高针对低表达标志物的抗体浓度，延长孵育时间，使两种标志物的荧光信号差异更加明显，便于准确区分阳性细胞群。

（四）复杂配色参考建议

对于五色及以上的复杂配色方案，建议科研人员查阅相关文献，或者咨询抗体厂商。随着科研需求的不断提升，多色流式实验越来越普遍，但复杂的配色方案涉及多种荧光素的选择和搭配，需要综合考虑荧光素的光谱特性、抗体的特异性、仪器的检测能力以及实验样本的特点等多个因素。查阅文献可以借鉴前人的成功经验，了解不同荧光素组合在实际实验中的效果和注意事项，避免走弯路；咨询抗体厂商则能获得专业的技术支持，厂商的技术人员可以根据实验目的、样本类型和仪器设备等情况，为科研人员提供个性化的抗体和荧光素组合建议，确保所选方案能够满足实验要求，获得理想的实验结果。一些知名的抗体厂商还会在其官方网站上提供多色实验的配色指南和案例分享，科研人员可以参考这些资源，结合自己的实验需求进行设计。例如，BD Biosciences 等公司的网站上，不仅有详细的抗体产品信息，还提供了针对不同实验目的和仪器的多色配色方案示例，科研人员可以根据自己的实际情况进行调整和优化。

五、如何调补偿

在多色流式实验中，由于不同荧光素的光谱存在重叠，补偿调节是必不可少的步骤。以 FITC 和 PE 两种荧光素为例，在 550nm 附近，它们的光谱出现重叠。调补偿的过程可以用 “横平竖直” 来形象概括。在实际操作中，以 CD3-FITC，CD4-PE 的染色补偿调节为例，需要通过调整补偿参数，使阴性细胞群在各个荧光通道的信号尽可能呈现 “横平竖直” 的分布状态。具体来说，就是在流式细胞仪的数据分析软件中，逐步调整补偿系数，观察阴性细胞在不同荧光通道的散点图分布，当阴性细胞在各个通道的信号分布接近水平和垂直方向时，表明补偿调节较为准确。补偿调节需要耐心和细心，因为不当的补偿调节会导致数据偏差，影响对细胞亚群的准确分析。如果补偿过度或不足，可能会使原本阴性的细胞被误判为阳性，或者掩盖阳性细胞的信号，从而得出错误的实验结论。因此，掌握正确的补偿调节方法对于获得准确的多色流式实验结果至关重要。在进行补偿调节前，建议先进行单染对照实验，确定每个荧光素单独标记时的信号分布情况，为后续的补偿调节提供准确的参考依据。例如，在进行三标实验（如 CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC）时，分别制备只标记 CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC 的单染样本，通过检测这些单染样本，确定每个荧光素在不同通道的信号强度和分布范围，然后在多色实验中，根据这些数据进行补偿调节，能够更准确地消除光谱重叠的影响。

六、同型对照

同型对照在流式实验中起着关键作用，其目的是减少背景干扰，更准确地展现抗原与抗体的结合强度。尤其对于一些胞内蛋白、低表达或连续表达